2022年3月，中國科學院動物學研究所干細胞與生殖生物學國家重點實驗室焦建偉老師、王雁玲老師及北京大學杜鵬老師、靳蕾老師在知名期刊Cell Stem Cell（IF: 24.633）在線發表了題為“Decoding the temporal and regional specification of microglia in the developing human brain”的研究文章，通過對人類胚胎各腦區的小膠質細胞的單細胞轉錄組分析，全面地揭秘了發育階段人腦小膠質細胞的區域特異性和狀態轉換的時空動力學，并在和小鼠聯合分析中，比較了兩物種間狀態轉換的保守性和分子差異。安諾優達為本次研究提供了10X單細胞轉錄組測序服務。
研究背景
在腦部發育和神經炎癥領域，作為中樞神經系統（CNS）的天然免疫細胞——小膠質細胞發揮著重要的作用，然而卵黃囊組織中相同紅髓系祖細胞的小膠質細胞在四個腦區（大腦皮層、間腦、中腦和小腦）的發育路徑、狀態轉換、相關功能特征等領域的研究尚不清楚。
在小鼠的scRNA-seq研究中，小膠質細胞高度異質性和發育相關復雜性的特點已得到證實。此次研究者以人類胚胎不同腦區的小膠質細胞為研究對象，首次發現小膠質細胞在早期胚胎發育中的狀態轉變，并評估了不同物種之間狀態轉換的保守性和分子差異。
實驗材料
人類胚胎Carnegie Stage (CS) 12卵黃囊和頭部組織；
不同孕期的不同腦區包括大腦、間腦、中腦、小腦。
測序策略
10x Genomics單細胞轉錄組測序
研究思路
研究結果
小膠質細胞單細胞轉錄組圖譜的構建
研究者使用10X單細胞轉錄組測序技術構建了人類胚胎腦部小膠質細胞的單細胞轉錄組圖譜，根據分選出的CD45+CD33+ 細胞，對卵黃囊、頭部組織、在多個原腸胚形成周的大腦不同解剖位置多位置成分進行分析，識別出20個cluster，成功定義起源、增殖、免疫應答和神經元基因富集四大類小膠質細胞。源于卵黃囊的早期小膠質祖細胞，在人類CS12胚胎的頭部表現出細胞增殖、免疫反應和神經系統發育三個明顯的分化潛能。
圖1 人腦不同發育區域小膠質細胞的scRNA序列和小膠質祖細胞的早期發育
兩個小膠質細胞區域規范的發育軌跡——神經元基因富集和免疫
在大腦發育的不同階段，富含神經元基因的小膠質細胞早在GW8短暫地出現過；免疫小膠質細胞也在后期（GW23左右）表現出其區域特異性
因此通過Monocle2和URD進行擬時間分析，重現同組CS12原始髓系祖細胞的神經元基因富集和免疫相關小膠質細胞的發育軌跡，結果表明來自CS12卵黃囊和頭部（C2/C3）的小膠質祖細胞首先開始增殖，形成不同周期階段（C6/C9/C10）的小膠質細胞，從而向免疫和神經元基因富集兩種分化方向過渡。
圖2 小膠質細胞區域特異性的發育軌跡
免疫相關區域特異性小膠質細胞的獨特特征
研究者進一步對兩類區域特異性小膠質細胞進行探索。富含免疫或神經元基因富集的小膠質細胞攜帶轉錄組信息不同，這可能與中樞神經系統早期發育四個腦區的各種功能和動態微環境有關。為更準確分析胎兒中樞神經系統早期發育小膠質細胞的狀態轉換，使用FACS和10x單細胞轉錄組測序，從Cor區分離并富集CD45IntCD11Bpos陽性細胞，最后獲得25891個小膠質細胞，從而利用新發現的亞群更全面地構建了大腦皮層小膠質細胞的高分辨率發育圖譜。
胎兒小膠質細胞的區域特異性和狀態轉換之間也表現出了明顯的潛在聯系。干擾人類小膠質細胞內穩態基因可使人類小膠質細胞從相對靜息狀態退出，過渡到激活狀態。經典穩態基因SLC2A5與CNS疾病相關的基因的高表達共同誘導激活了免疫相關的小膠質細胞簇，從而揭示出胎兒腦部特異性的小膠質細胞的獨特特征。
圖3 區域特異性小膠質細胞的獨特特征
圖4 區域特異性的胎兒小膠質細胞靜息——激活狀態改變
人和小鼠發育中狀態轉換存在保守性和分子特征差異
選用小鼠卵黃囊（E8.5）、頭部組織（E9.5）及大腦Cor組織（E10.5-P20）的Cd45intCd11bpos細胞進行單細胞轉錄組測序，人類小膠質細胞通過激活CX3CR1、TMEM119和P2RY12/13的表達，在GW8開始獲得內穩態。誘導典型的小膠質細胞激活基因，可使其在GW23被沉默，這代表人類胚胎活動狀態的轉變。小鼠中靜息相關基因的誘導主要發生在E13.5，直至小鼠出生這些基因才出現減少，小膠質細胞進入活躍期。因此發育的小膠質細胞在靜息——激活狀態轉換是保守的，但分子特征是不同的。
巨噬細胞相關基因方面，LYVE1、MRC1和F13A1在人類早期YS或head中的表達最高，然后逐漸降低。相比之下，小鼠Lyve1、Mrc1和F13a1基因表達在E10.5中高度富集，在早期胚胎發育中下降。人類 CS12-Head在轉錄組水平上與小鼠E10.5最相似。大多數其他細胞類型可以合并，人類和小鼠的幾種細胞類型和發育途徑也是保守的。
進一步DEGs的分析表明，人和小鼠小膠質細胞間在物種特異性基因的表達、功能亞類上存在確定性的差異?；蚣患治觯℅SEA）顯示，人類的細胞粘附分數、細胞因子相互作用、MAPK信號通路和Toll樣信號通路更豐富。此外，研究者還鑒定出了PT-MG、AR-MG、CM-MG、MiR-MG和SP-MG集群中的人類和小鼠DEG。
圖5 人和小鼠小膠質細胞在發育中狀態轉換的保守性
圖6 人和小鼠小膠質細胞分子特征的差異
總結
安諾優達作為單細胞測序技術國內最早的服務提供商之一，從傳統單細胞測序到10x Genomics高通量單細胞測序；從單細胞轉錄組學至基因、表觀、蛋白質的多組學平臺；從常規轉錄組測序到空間轉錄組測序，涵蓋三大組學，九大單細胞產品。為您的單細胞科研之路掃平障礙。
參考文獻
Yanxin Li, Zhongqiu Li, Min Yang, etal.Decoding the temporal and regional specification of microglia in the developing human brain[J]. Cell Stem Cell,2022.
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文案：市場推廣經理 崔競丹